SEM en falso color de Gemmatimonas phototrophica. (Jason Dean/Czech Academy of Sciences)
El hallazgo más reciente de bacterias fototróficas, (Zehg et. al., 2014), corresponde a la especie Gram-negativa Gemmatimonas phototrophica, una inusual bacteria fotoheterótrofa facultativa incapaz de fijar carbono a partir de CO2, que crece igualmente bién en obscuridad, de manera que la fotofosforilación complementa la fosforilación oxidativa.
Perteneciente al phillum Gemmatimonodota, fué colectada por primera vez en un lago al occidente del desierto de Gobi, siendo el primer reporte del grupo con evidencia de fotosíntesis anoxigénica.
Tras realizar el estudio genómico correspondiente, Zehg et. al, op. cit, identificaron un Cluster fotosintético completo (PGC) cuyo análisis comparativo con otras especies microbianas sugirió una adquisición temprana via transferencia horizontal desde una bacteria púrpura fotosintética, ver fig 1.
Éste hallazgo es la primera evidencia de transferencia horizontal fototrófica entre phyla bacterial distante, lo que proporciona nuevos y valiosos elementos a tener en cuenta en la evolución de la fotosintesis microbiana.
Figura 1. Referenciación genética del PGC de AP64 comparado con Proteobacterias (Rubrivivax gelatinosus y Rhodobacter capsulatus), y Firmicutes (H. modesticalum). Nótese la coincidencia particularmente con R. gelatinosus. Fuente: Zeng et.al. 2014: http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1400295111
Con éste nuevo encuentro ya son siete los grupos bacterianos fotosintetizadores descritos a la fecha: Cyanobacterias, Proteobacterias alfa y gamma (purpura no sulfurosa y sulfurosa respectivamente), Chlorobi (GSB) , Chloroflexi (FAP) , Firmicutes (Heliobacterias) , Acidobacteria y finalmente Gemmatimonadetes (Gemmatimonas).
El complejo LHC/RC, denominado en este grupo RC-dLH precenta una pseudosimetría C8, con el complejo antena (LHC) de anillo doble rodeando el centro de reacción (RC).
COMPLEJO ANTENA LHC
LHC está constituido por dos anillos concéntricos de corte ligéramente elipsoidal. El anillo interno, LH1, similar al complejo LHI de bacterias púrpura, recibe energía lumínica del anillo externo y la transmite al centro de reacción. El anillo externo, LHh, responsable de capturar la energía solar y transmitirla a los pigmentos de anillo interno, es un nuevo diseño de complejo antena solo presente en este grupo bacteriano, ver Fig.1.
Figura 1. Estructura general del complejo RC-dLH. Se excluyen en la figura los pigmentos responsables de la cadena de transporte de electrones en el centro de reacción.
ANILLO INTERNO
El anillo interno, de estructura cilíndrica,está conformado por 16 unidades heterodiméricas de polipéptidos transmembrana α/β , α internas, β externas al anillo. Entre las subunidades α y β de cada heterodímero se ligan no covalentemente un par de pigmentos BChl a y un all-Trans carotenoide, Gemmatoxanthina, con bandas de absorción entre 400 y 600 nm, picos a 478, 507 y 542 nm. (Zehg et. al., 2014).
El par Bchl, B868a/B868b, absorbe energía a 868 nm, sus planos tetrapirrólicos son perpendiculares a la superficie citoplasmática, plano XZ, ver fig.2, y su posición es distal respecto al centro RC. El caroteno, con orientación radial al complejo, atravieza el complejo desde extremo distal a proximal, tiene función fotoprotectora y de captura y transmisión de energía a las Bchl, ver Fig.2.
Figura 2. Unidad heterodimérica y pigmentos asociados al anillo LH1. Simplificado de Quian et.al., 2022.
ANILLO EXTERNO
El anillo externo, de estructura ligeramente cónica, denominado LHh, está conformado por 24 heterodímeros polipeptídicos α/β, cada uno con un par de clorofilas BChl B816 en posición distal, alineadas en el plano XZ, una clorofila BChl B800 proximal alineada en el plano YZ, y un caroteno GTX radial atravezando el complejo, de manera similar a su posición en LH1, quedando en consecuencia los tres BChl con sus planos tetrapirrólicos perpendiculares al plano XY de la superficie citoplasmática. ver Fig.3.
Figura 3. Unidad heterodimérica y pigmentos asociados al anillo LHh. Simplificado de Quian et.al., 2022.
La Fig 4 representa la transferencia de energía entre y dentro de los dos anillos LH1 y LHh. Aunque no está referenciado en la literatura, las transferencias electrónicas deben obedecer a resonancia no radiativa de Förster.
Fig 4. Cinética de transferencia de energía en el complejo RC-dLH1.
CENTRO DE REACCIÓN RC
La arquitectura general del centro de reacción del grupo es similar al presente en proteobacterias fototróficas, ver lectura de bacterias púrpura, con un heterodímero polipeptídico principal conformado por las subunidades L y M y un citocromo c soluble periplasmático responsable del transporte cíclico de electrones desde el citocromo BC1 hasta RC.
En cuanto a los pigmentos involucrados en RC, equivalentes a los presentes en bacterias púrpura, ver lectura correspondiente, comprenden un par especial Bchla 870 receptor primario de la energía lumínica proveniente de LH1, un par ACC accesorio, ver Fig 1., dos moléculas de bacteriopheophytin a (BPhe a), un carotenoide del tipo spirilloxanthina, tres menaquinona-8 (MQ8), una en posición QA, una en posición QP y una tercera nueva adyacente a la cara interna del anillo LH1, cerca al sitio QB, designada QF.
La Figura 5 resume el complejo fototrófico de este nuevo grupo.
Figura 5. Aparato fototrófico en Gemmatimonas
METABOLISMO
La transferencia horizontal de un plásmido proveniente de bacterias púrpura fotosintéticas fué seguramente el elemento responsable de la adquisición de la maquinaria fototrófica en la especie en estudio.
Sin embargo, la transferencia no involucró el genoma responsable de otras piezas requeridas para una función fototrófica completa. Así, en la especie no se ha evidenciado presencia de sistemas de captura de electrones desde moléculas donoras, orgánicas o inorgánicas, de manera que la función fototrófica depende exclusivamente de la retroalimentación cíclica de electrones desde el citocromo bc1 hacia el centro de reacción mediado por un cyt c como transportador cíclico de electrones. Adicionalmente, no se han evidenciado tampoco rutas reductoras asociadas a la cadena fototrófica, tipo ciclo reverso TCA, ruta reductora de las pentosas, ciclo del hidroxypropianato, etc, vías metabólicas características de los demás grupos bacterianos fototróficos, de manera que el ATP, producto final del complejo adquirido, alimenta directamente el complejo responsable de la fosforilación oxidativa, ver Fig.5. Esta nueva ruta alterna de síntesis de ATP le permite a la especie ahorrar moléculas orgánicas donoras de carbono en presencia de luz.
Figura 5. Cibernética de captura de eneregía en Gemmatimonas.
En cuanto al aporte del complejo LHC/RC a la función respiratoria, Koblízek et.al, 2020 resaltan varios puntos:
Exposición de irradiancia lumínica de 100 μmol de fotones m-2 S-1 incrementó el crecimiento de las colonias bacterianas en aproximadamente un 30% , lo que sugiere que el complejo bioquímico adquirido optimiza la captura de energía durante exposición directa a la radiación solar.
La exposición a radiación solar mejoró igualmente la asimilación de compuestos orgánicos. Así, a intensidades por encima de 400 μmol de fotones m-2 S-1 , la asimilación de glucosa fué 2.77 veces mayor que la la obtenida en obscuridad.
No se evidencian mecanismos adaptativos a la luz, de modo que se produce la misma cantidad de complejos PS tanto en luz como en obscuridad.
En contraste con otras bacterias anoxigénicas fototróficas que crecen aeróbicamente y sintetizan BChl a solo en obscuridad, la especie en estudio no crece bajo condiciones totalmente aeróbicas y produce BChl a incluso bajo luz contínua.
En conclusión, G. phototrophica es un fotoheterótrofo típico facultativo, utiliza carbono orgánico para su biomasa y metabolismo, pero la luz mejora significativamente su crecimiento.
Finalmente, el hallazgo de la especie demuestra la capacidad bacteriana de importación via transferencia horizontal de genomas de función completa, lo que abre nuevas posibilidades para entender la evolución bacteriana. Para ilustrar el alcance del hallazgo, la presencia de dos complejos fotosintéticos PSI y PSII complementarios en cyanobacterias se ha explicad bajo la teoría de duplicación, evolución y diferenciación interna de los dos complejos fotosintéticos en una especie bacteriana para una posterior combinación evolutiva de los dos complejos en una sola maquinaria altamente eficiente.
El hallazgo abre otras posibilidades, con evolución a partir de transferencias horizontales interespecíficas, eventualmente interphila, entre donor PSII (o PSI) a aceptor con la contraparte complementaria.
BIBLIOGRAFÍA CITADA Y SUGERIDA
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La presente lectura sobre cyanobacterias es el punto de convergencia de todas las lecturas previamente desarrolladas sobre el fenómeno de la fotosíntesis, pues este grupo bacteriano fué hace 2,500 millones de años punto de convergencia de evolución Marguliana, como también punto de divergencia Darwinista, lo que definió la impronta de la vida en nuestro planeta.
A las cyanobacterias se le debe la atmósfera planetaria rica en oxígeno, su color azul visible desde el espacio, las bandas rojas de hierro Fe3+ (Hematita Fe2O3) y Fe2+/Fe3+ (magnetita), huella geológica de su actividad bioquímica, como también la eucariogénesis y la evolución de las plantas y en último término de los animales pluricelulares, de manera que la especie humana no existiría si hace 2,500 millones de años no hubieran dominado, como dominaron, estas revolucionarias bacterias fotosintéticas.
Las Cyanobacterias son un grupo de bacterias Gram-negativas (Phyllum Cyanobacteriota) caracterizadas por realizar fotosíntesis oxigénica mediante un complejo bioquímico dual PSII-PSI, lo que las diferencia de los demás grupos fotosintéticos bacterianos, donde PSII o PSI están presentes, pero nunca operando a la vez, ver fig 1.
El complejo fotosintético se localiza en invaginaciones intracelulares de la membrana plasmática denominadas membranas Thylakoides, precursoras de las estructuras thylakoidales propias de los cloroplastos presentes en las células del reino vegetal.
Figura 1. Complejo fotosintético de Cyanobacterias
La maquinaria fotosintétic de las cyanobacterias comprende los siguientes subsistemas:
Complejo antena (Light Harvest Complex) denominados phycobilisomas, los cuales están intimamente ligados a los fotosistemas PSII y PSI
Fotosistemas PSII y PSI propiamente dichos, encargados el primero de reducir quinonas y el segundo reducir NADH
Citocromo b6f, transportador de electrones hacia PSI y responsable de la generación del potencial protónico PMF
Centro OEC (Oxigen Evolving Center) responsable de la oxidación del agua.
ATP Synthase, que, aunque no forma parte del complejo, es fundamental para la síntesis de ATP
A continuación un resumen general de los diferentes componentes de la maquinaria:
PHYCOBILISOMA (PBS)
Durante el proceso de la fotosíntesis, la energía lumínica es capturada por complejos antena denominados Phycobilisomas (PBS). La energía es luego transmitida hacia los centros de reacción (RC), donde pares especiales de clorofilas Chla son exitados a niveles energéticos que permiten la liberación electrónica en Chla para iniciar la cadena de transporte de electrones (ETC) , motor final de las maquinarias fotosintéticas.
Cada Phycobilisoma está compuesto por seis (raramente ocho) estructuras proteicas de corte cilíndrico en disposición radial, ver Fig 2., convergiendo hacia un nucleo proteico central.
Figura 2. Phycobilisoma. A: Vista general. Se incluye con propósito ilustrativo en tonos suaves el centro de reacción. B: Detalle estructural. C: Disposición de subunidades en los trímeros.
RADIOS:
Cada radio a su vez está conformado por 2 – 6 discos de phycobiliproteinas (10-12 nm de diámetro), los cuales actúan como unidades de captura y transferencia de energía lumínica hacia el nucleo del complejo. Los discos, de estructura trimeral, pueden operar de manera individual, trímeros (αβ)3 , o por parejas enlazadas por proteinas linker, en cuyo caso su estructura es hexameral (αβ)₆, ver Fig 2b y 2c. El rol de la proteina linker no es solamente enlazante, también contribuye a ajustar los niveles energéticos y a dirigir la energía hacia el nucleo del complejo antena.
De distal a proximal, y dependiendo de los cromóforos que contienen, las proteinas de los radios se clasifican en:
PHYCOERITHRINAS (PE) → Colectores primarios de luz .
PHYCOCYANINAS (PC) → Transfieren la energía colectada por PE hacia el nucleo del phycobilisoma.
La estructura de los radios puede variar acomodandose a la disponibilidad de energía. Así, PE puede estar ausente, en cuyo caso el colector primario es PC. De manera similar, PC puede faltar, y en ese caso PE comunica directamente con los cromóforos del nucleo.
NÚCLEO
El núcleo está conformado por 2-3 cilindros dispuestos horizontalmente, ver Fig.2a, con 6-9 discos αβ3 por cilindro, agrupados por parejas mediante proteinas linker, resultando en estructuras αβ₆.
La proteina del nucleo corresponde a ALOPHYCOCYANINA (APC), derivando su nombre del pigmento correspondiente, Alophycocyanobilina, el cual es exitado por los cromóforos radiales que actúan a modo de embudo energético. Este pigmento es el responsable de la exitación del par especial de clorofilas localizada en el centros de reaccion.
El núcleo tiene en consecuencia una función conectora entre el complejo antena y el centro de reacción RC, de manera análoga a la capa FMO de los clorosomas propios de las baterias verdes del azufre (ver lectura correspondiente), si bién presentan diferencias significativas:
El núcleo del ficobilisoma es una estructura grande, modular y con alta plasticidad morfológica, adaptable en número de discos y organización de los mismos dependiendo de las condiciones lumínicas, mientras que FMO es un complejo pequeño,rígido en estructura, no adaptable a fluctuaciones de las condiciones ambientales.
El cromóforo contiene Aloficocianina, conecta con el par especial Chla en RC P680 de (PSII y P700 de PSI), mientras que FMO contiene Bacterioclorofila y transmite la energía al par Bchla P840 en RC.
El phycobilisoma requiere para su exitación de una intensidad de luz mucho mayor que el chlorosoma, lo que define y diferencia los nichos ecológicos ocupados por ambos grupos biológicos.
El número de pigmentos presentes en el phycobilisoma es muchísimo menor que el del chlorosoma (decenas en el ficobilisoma, cientos de miles e el corosoma).
Los pigmentos del phycobilisoma requieren proteinas estructurantes donde se anclan y organizan, mientras que la organización y distribución de pigmentos en el chlorosoma obedece a una estructura semicristalina auto-organizada, y salvo la envoltura que los contiene y la unidad conectora (FMO), hay ausencia proteínica al interior del complejo antena.
El phycobilisoma es típico de linajes oxigénicos evolutivamente recientes, mientras que el chlorosoma es típico de fototrofía anoxigénica mucho mas antigua.
PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS
Para que la energía fluya desde el Phycobilisoma hasta PSII/PSI mediante transferencia no radiativa FRET se requiere cumplir un conjunto de condiciones:
Energías de exitación decrementales en el sentido del flujo ETC
Distancias reducidas entre cromóforos adyacentes
Superposición espectral entre las frecuencias de emisión y frecuencias de exitación de pigmentos en la cadena
Orientación favorable a FRET entre los dipolos
Adecuada vida media de estados exitados
Las proteínas PE, PC y APC contienen los pigmentos de los tipos Phycoerytrobilina, Phycocyanobilina y Alophycocyanobilina respectivamente, cuyas energías de exitación/emisión cumplen las condiciones descritas, lo cual garantiza el flujo de energía en la secuencia
PE → PC → APC → PSII/PSI
El flujo de energía y la tabla de valores de exitación/emisión en el phycobilisoma se ilustran en la Fig 3.
Figura 3. Flujo de energía y valores de absorción/emisión correspondientes a las etapas de flujo de energía en el phycobilisoma
Los pigmentos fotosintéticos obedecen a una estructura tetrapirrólica de anillo abierto, con diferencias en el radical asociado al carbono 18 (Vinil para Phycoerytrobilina, Ethil para Phicocyanobilina y Alophycocyanobilina), y con diferencias en las posiciones de algunos enlaces Pi conjugados entre Phycocyanobilina y Alophycocyanobilina , ver Fig.4.
Estas diferencias moleculares, combinadas con las cargas eléctricas de los aminoácidos que las rodean, definen las energías de absorción/ emisión para cada tipo de pigmento.
Para los tres casos, los pigmentos están anclados a las proteínas vía residuos Cisteína mediante enlaces covalentes Tioéter.
Figura 4. Estructura molecular de los pigmentos involucrados en el phycobilisoma
FOTOSISTEMA PSII
La energía capturada y transmitida desde los pigmentos de las radios hasta el nucleo del complejo es transmitida al par especial de clorofilas localizado en la base del fotosistema PSII, el cual es un complejo de proteínas transmembrana en un arreglo heterodimérico D2-D1, ver Fig.5.
El acoplamiento entre los pigmentos del nucleo y el par especial de clorofilas es mucho mas fuerte y mucho más coherente que el acoplamiento entre pigmentos al interior del phycobilisoma, lo que lo define como un caso extremo de resonancia de Förster, renombrado recientemente como EET (Exitation Energy Transfer)
Figura 5. Fotosistema PSII. Estructura y cadena de transporte ETC.
Mediante EET, la energía procedente del complejo antena exita el par especial de clorofilas P680 llevandolo a su forma P680*, elevando su potencial redox de
+ 1,2 → -0,9 eV
Si los requerimientos energéticos celulares son bajos, el par especial retorna al estado Ground mediante fluorescencia, ver Fig 6.
Figura 6. Exitación/relajación electrónica en pigmentos fotosintéticos
Ante demanda energética, el electrón exitado π* (procedente de la cadena de enlaces conjugados), no retorna a ground sino que se libera oxidando el par especial de clorofilas Chla , iniciando una cadena de transporte de electrones ETC, que en su primera fase (PSII) sigue la ruta ETC
P680* → Pheophytin → Quinone A → Quinonne B → Plastoquinol
El pigmento Phaeophitin corresponde estructuralmente a una molécula de clorofila Chla sin presencia del átomo central de magnesio coordinado. Las quinonas corresponden a Plastoquinonas, muy estables en ambientes ricos en oxígeno.
Para reducirse completamente, las plastoquinonas PQA y PQB requieren dos electrones, de manera que el ciclo de exitación y liberación electrónica del par especial de clorofilas debe repetirse dos veces, y previamente dos fotones deben ser capturados y transmitidos a RC secuencialmente por parte del complejo antena.
Una vez completamente reducida, PQB2- captura dos protones procedentes del citoplasma adquiriendo la forma de Plastoquinol PQH2 :
PQB → PQB∙− → PQB2- → PQH2
Mientras que PQA está ligada fuértemente a PSII, PQB es fácilmente liberada en su forma plasoquinol, migrando a un reservorio especial de quinonas localizado en el espacio intramembrana thylakoidal denominado pool de quinonas, ver Fig 7.
Figura 7. Diagrama de flujo de energía en el complejo fotosintético de Cyanobacterias, reacciones dependientes de luz.
Para que la cadena de transporte ETC siga una dirección “cuesta abajo” desde P680* hasta PQH2 en PSII, (y más adelante hacia el pool de quinonas y finalmente hasta P700 en PSI), los “eslabones” de la cadena de transporte deben estar acoplados de modo que sus potenciales redox vayan disminuyendo paso a paso, ver Fig.8.
El tránsito de electrones a lo largo del proceso, al igual que en los complejos fotosintéticos presentes en los demás grupos bacterianos y en la maquinaria de foforilación oxidativa mitocondrial, permite generar un gradiente protónico intermembrana (PMF) indispensable para la síntesis de ATP.
Figura 8. Diagrama Z en el complejo fotosintético PSII/PSI de Cyanobacterias.
El transito de electrones descrito en la fig. 8 se conoce como ESQUEMA Z, que en resumen describe la forma en “Z” del transporte no cíclico de electrones durante las reacciones dependientes de la luz en la fotosíntesis de cyanobacterias y plantas superiores.
El Esquema “Z” comprende dos fases, correspondientes a PSII y PSI respectivameente. PSI maneja niveles energéticos mayores que PSII, lo que define para PSII un alto poder oxidante y para PSI un alto poder reductor, convirtiendo al sistema combinado en una maquinaria altamente oxidante, altamente reductora, que en la práctica se traduce en capacidad de oxidar H2O y capacidad de reducir NADP+ de manera directa. Comparativamente, maquinarias de un solo fotosistema, como las presentes en bacterias púrpura y bacterias verdes del azufre, la eficiencia fotosintética general está limitada. En las primeras, el débil poder reductor impide la síntesis directa de NADPH, teniento que invertir valioso ATP en su producción, mientras que en bacterias verdes del azufre ocurre lo contrario. Se habilita la síntesis directa de NADPH pero el bajo poder oxidante impide la utilización de H2O como fuente de electrones, ver Fig 9.
Figura 9. Centros de reacción de Bacterias púrpura y verdes del azufre
Hace algo cercano a 2,500 millones de años, sea por endosimbiosis seriada entre linajes de bacterias con maquinarias complementarias tipo I y tipo II, sea por adquisición de un segundo fotosistema por evolución propia , o sea por transferencia genética horizontal entre linajes, en lo que podría ser una especie de endosimbiosis bioquímica, de alguna manera dos maquinarias fotosintéticas se combinaron resultando en una máquina dotada de un “carburador de doble venturi” capaz de oxidar el agua, lo que marcó un punto de no retorno en la vida del planeta.
La utilización de agua como fuente de electrones en éste novedoso proceso fotosintético ha sido de lejos la más importante y trascendental innovación evolutiva alcanzada en el planeta. El nuevo recurso eliminó la dependencia de electrones procedentes de fuentes de limitado acceso (H2S, moléculas orgánicas, etc) permitiendo que las cyanobacterias pudieran ocupar todos los rincones del planeta donde hubiera agua líquida, convirtiendose así en el grupo más exitoso y de lejos más dominante que haya existido hasta la fecha .
Pero esta dominancia tuvo su lado obscuro, pués también fué la responsable de alterar profundamente la atmósfera primigenia, rica en dióxido de carbono y metano, por una atmósfera de oxígeno, lo que amenazó seriamente las formas de vida anoxigénica que prosperaban en ese entonces .
POOL DE QUINONAS
Como se mencionó anteriormente, el pool de quinonas es un depósito de quinonas oxidadas y reducidas ubicada en el espacio intramembrana tylakoidal, adyacente a los complejos fotosintéticos PSII, PSI y al Cyt b6f.
La naturaleza hidrofóbica de las quinonas permite que éstas permanezcan confinadas en dicho espacio, repelidas por los radicales fosfato de la capa bifosfolipídica.
La proporción y concentraciones de las formas PQ / PQH2 es dinámica y depende de los requerimientos fisiológicos, siendo PQH2 la portadora de energía desde PSII hacia en citocromo b6f.
CITOCROMO b6f
El complejo Cyt b6f es un complejo proteínico transmembrana con moléculas Heme como cofactores, ver Fig 10. Sus funciones consisten en transferir electrones al fotosistema PSI orientados a síntesis de NADPH y mover protones del citoplasma al lumen thylakoide mediante una secuencia de oxidaciones y reducciones de quinonas aprovechando una cadena de transporte de electrones ETC habilitada por cambios reversibles entre los estados de oxidación Fe³⁺ / Fe²⁺ de átomos de hierro presentes en moléculas Heme al interior del complejo.
Fig 10. Estructura del citocromo Cytb6f, y dinámica de transporte de electrones ETC.
La subunidad Cyt B6 tiene dos sitios activos, Qp oxidante y Qn reductor, responsables de alojar las quinonas a oxidar y reducir, respectivamente.
Del pool de quinonas es transladada una molécula PQH2 a Qp donde es oxidada a su forma PQ. Dos protones y dos electrones son liberados en la reacción. Los protones migran al lumen htilakoide donde contribuyen a incrementar la fuerza protomotriz PMF que luego se utilizará pra la síntesis de ATP.
En cuanto a los electrones, tienen dos destinos diferentes:
El primer electrón es capturado por el complejo 2Fe2S, cofactor de la proteína Rieske (Iron Sulfur Protein ISP) quien a su vez reduce una cuproproteina móvil presentee e el lúmen thylakoide denominada Plastocianina, responsable final de la transferencia de electrones desde Cyt b6f hasta PSI siguiendo la ruta
Qp → Cytf → [2Fe2S] → PC → P700–
En cuanto a Rieske, el centro [2Fe2S] está coordinado por dos histidinas y dos cisteínas, en lugar de las cuatro Cystinas que caracterizan a la ferredoxina [2Fe2S], ver Fig 11.
Fig 11. Centro [2Fe-2S] presente en la proteina Rieske
Respecto a la Plastocianina (PC), se trata de una proteína móvil transportadora de electrones con un átomo de cobre como cofactor anclado a la proteina mediante cuatro ligandos: Imidazol de dos residuos histidina (His37, His87) , thiolato de Cys84 y thioether de Met92, lo que le confiere una estructura de tetrahedro irregular. Durante el proceso el cobre es reducido de la forma
Cu²⁺ → Cu⁺
En estado reducido, PC migra en el lumen hasta el PSI, donde dona el electrón a P700⁺, volviendo a su forma oxidada Cu²⁺.
Respecto al segundo electrón, este sigue la ruta
bl → bh (o bl → cn) → PQ
mediante cambios en los estados de oxidación Fe3+ – Fe2+ de los Heme correspondientes, para finalmente reducir parcialmente una plastoquinona PQ localizada en el sitio Qn .
Son necesarios dos ciclos como el descrito arriba para reducir completamnte la plastoquiuinona PQ localizada en Qn.
Una vez totalmente reducida, la plastoquinona incorpora dos protones procedentes del citoplasma a su estructura, retornando luego al pool de quinonas en su forma PQH2 .
Completados los dos ciclos, cuatro protones son transladados del citoplasma al lumen tylakoidal.
FOTOSISTEMA PSI
El fotosistema PSI es el último complejo involucrado en la cadena de transporte de electrones, su función es reducir NADP+ a partir de la oxidación del átomo de cobre precente en PC, por lo cual se conoce atmbién como Plastocianina-NADP Oxidoreductasa., ver Fig 12.
Figura 12. Fotosistema PSI. Estructura y cadena de transporte ETC
Como en el caso de PSII, complejos antena tipo phycobilisomas son responsables de transferir la energíalumínica al par especial de clorofilas, en este caso al dímero P700, con la energía necesaria para que un electrón sea liberado del par especial iniciando la cadena de transporte correspondiente.
Una vez liberado el electrón, el par especial adquiere el potencial oxidante necesario para oxidar la plastocianina PC procedente del complejo Rieske, retornando el par especial a su estado Ground, cambiando el estado de oxidación del átomo de cobre:
Cu⁺ → Cu2⁺
Dos ramas simétricas de cofactores están presentes en PSI. Las ramas parten de P700 al interior de las subunidades PSaB y PSaA, cada una conteniendo una molécula accessoria de Chla ( A), una segunda monomérica Chla ( A0) y una filoquinona (A1). Las dos ramas convergen en un cluster [4Fe-4S] central (Fx), ver Fig 13, apuntando hacia el citoplasma.
A pesar de existir dos ramas paralelas de cofactores A-Ao-A1, solo una es responsable de la cadena de transporte de electrones, usualmente la rama localizada en PSaA, mientras que la segunda rama, presente en PSaB , permanece inactiva.
De Fx la energía es transferida hacia dos cluster [4Fe-4S] denominados FA y FB localizados en la subunidad proteínica PsaC, para finalmente reducir una ferredoxina 2Fe-2S Fe-S , denominada Fdx, localizada en el citoplasma.
La ferredoxina requere dos electrones para reducirse completamente, de modo que dos ciclos secuenciales PC-Ferredoxina deben ser completados.
Éste agente reductor no transfiere directamente electrones a NADP+ , requiriendo una enzima intermediaria denominada ferredoxina-NADP+ reductasa (FNR). La transferencia de electrones se realiza en dos pasos:
FNR → Flavin-Semiquinona → FADH2
Una vez completamente reducida, FNR transfiere los dos electrones a NADP+ .
En resumen, la cadena de transporte ETC en PSI sigue los siguientes pasos:
P700∗ → A → A0 → A1 → Fx → FA → FB → Fdx → FNR – NADPH
OXIGEN EVOLVING CENTER OEC
Con la síntesis de NADPH y la habilitación de síntesis de ATP mediante la generación de fuerza protomotríz PMF por el sistema parecería que el tema quedaría cubierto.
Sin embargo queda pendiente el tema de reposición de electrones en PSII para que la maquinaria fotosintética pueda operar ininterrumpídamente.
La oxidación de P680 inicializa el fljo ETC mediante la cesión electrónica, pero a su vez, gracias al alto poder oxidante adquirido, permite reincorporarlos desde la fuente primaria, H2O, mediante una innovacion evolutiva, El ciclo de Joliot-Kokmediado por Mn4CaO5 , ciclo que opera en un complejo proteínico denominado Oxigen Evolving Center, “OEC”.
Como core del complejo OEC y como centro oxidante se presenta una molécula de estructura cubana, ver Fig 13, y fórmula molecular Mn4CaO5, responsable final de la oxidación del agua.
Figura 13. Diagrama 3D de la molécula Mn4CaO5. Se incluyen en la molécula las cuatro moléculas coordinadas de agua
El tránsito de electrones desde MnCaO5 hacia el par de clorofilas es mediado por un residuo Tyr 161 (Yz), en la secuencia
H2O → Mn4CaO5 → Yz → P680*
Al ceder electrones, P680* adquiere un potencial oxidativo muy alto (~+1,25v) , lo que permite oxidar Tyr161 quien a su vez oxida MnCaO5 para que tras un ciclo repetido pueda oxidar el agua , ver Fig.14.
Figura 14. Ciclo de KOK. Las cuatro barras en cada estado representan los cuatro átomos de manganeso, barras azules indican átomos en estado de oxidación III, barras rojas estado IV.
Como etapa previa al ciclo de KOK, la energía de un fotón procedente del complejo antena promueve la liberación de un electrón en P680, lo que lo lleva a un estado P680* altamente oxidativo. Este potencial es transladado al centro OEC con el propósito final de oxidación del H2O.
El elemento responsable de los estados de potencial corresponde a los cuatro átomos de Mn, que pueden tener los siguientes estados de oxidación:
Las etapas del ciclo de KOK se pueden resumir así:
S0 → S1: Partiendo de un estado inicial en Mn4CaO5 con Mn1 – Mn3 en estado de oxidación III y Mn4 en estado de oxidación IV, P680* promueve la oxidación de Tyr161 y luego la oxidación de Mn3 en Mn4CaO5 (con la consecuente reposición electrónica en P680), lo que genera en el core de OEC un potencial de +0,8v.
S1 →S2: Segundo fotón incidente, segundo electrón liberado, se eleva el potencial oxidativo del core a de +0,8v a 0,9v , oxidación de Mn2 pasando del estado MnIII a MnIV, liberación de H+ al lumen thylakoide.
S2 →S3: Tercer fotón incidente, tercer electrón liberado, captura de una primera molécula de agua, liberación de H+ al lumen thylakoide, el core adquiere un potencial de ~+1,0 – +1,1, oxidación de Mn1 pasando del estado MnIII a MnIV.
S3 →S4 → S0: Cuarto fotón incidente y cuarto electrón liberado. Con todos los átomos de Mn en estado de oxidación +IV, el potencial de oxidación general es lo suficientememnte alto como para generar un enlace O-O a partir de H2O, de manera que sus electrones se puedan incorporan al sistema, retornando de paso los estados de oxidación de los átomos de Mn a sus condiciones iniciales para así poderse iniciar un nuevo ciclo.
S2 y S3 son estados metaestables, particularmente en ausencia o deficiencia de luz, pudiendo decaer el sistema a S0, lo que hace que el poder oxidante acumulado se pierda.
La secuencia presentada se basa en un modelo de oxidación de “valencia alta” (High valence), caracterizada por átomos de Mn en estados de oxidación III y IV.
Este modelo presupone en la etapa S4, previa la formación del enlace O-O, la oxidación de un átomo de Mn a un estado V, estado energéticamente extremo, difícil de explicar bajo el modelo de Lewis y en conflicto con algunos datos espectroscópicos experimentales.
Una segunda alternativa se basa en un modelo de bajo potencial (Low potential), en el que no es necesario recurrir a estados de oxidación extremos y donde la energía adicional es resuelta mediante Radicales Oxyl (O.), Puentes Oxo deprotonados y Oxidación centrada en ligandos, y no en los átomos de Mn.
Bajo este modelo, el manganeso Mn1 participa en S0 con un estado de oxidación II , y en general, a lo largo de todo el ciclo, los estados de oxidación del core son menores que los del modelo de potencial alto, ver Fig 15.
Este modelo explica de mejor manera el ciclo, no es necesario recurrir a estados energéticos extremos, pero por otro lado el hecho de manejar menores potenciales de oxidación abre interrogantes sobre la capacidad de oxidación del agua.
Para concluir, la sinergia bioquímica resultante de combinar los fotosistemas PSII y PSI en una única maquinaria fotosintética fuertemente oxidante y a la vez fuertemente reductora, sumado al desarrollo de un novedoso complejo bioquímico diseñado para extraer electrones del agua, permitió que toda una nueva propuesta bioquímica, la de las formas de vida aerobia, conquistara el planeta en una explosión evolutiva que aún hoy, después de 2,500 millones de años, nos acompaña.
Lidiar con el oxígeno, sin embargo, no ha sido tarea fácil para la vida, e incluso la maquinaria fotosintética que lo liberó por primera vez debe lidiar con él.
Los mecanismos de protección ROS, y en general las rutas de control diseñadas para proteger la maquinaria fotosintética, serán el tema de la próxima lectura.
Las bacterias verdes del azufre son un grupo bacteriano Gram (-) fotolitoautótrofo metabólicamente especialista, pertenenecen a la clase Chlorobia, Phyllum Bacteroidotas, caracterizadas por ser anaerobias estrictas .
Propias de ambientes anóxicos en fondos de lagos con alto contenido de azufre, utilizan H2S y en menor medida tiosulfatos y So elemental como donores de electrones, carecen del ciclo reductor de Calvin-Benson, en reemplazo fijan CO2 mediante el ciclo reverso del ácido tricarboxílico.
Su aparato fotosintético contiene complejos antena altamente eficientes denominados clorosomas, los cuales les permiten prosperar a bajísimas intensidades de luz, siendo de hecho el grupo fotosintetizador con menores requerimientos de energía lumínica reportado a la fecha.
Este grupo bacteriano utiliza el centro de reacción RC para producir reductantes fuertes, ATP y NADPH, mediante la oxidacion de los compuestos del azufre anteriormente mencionados.
Para activar la cadena de transporte de electrones, RC contiene como cofactor prostético un par de bacterioclorofilas BChla exitable a 840 nm, que les permite pasar de un estado GND un estado exitado P840*, ver Fig. 1.
Figura 1. Potenciales REDOX en la cadena ETC de las bacterias verdes del azufre.
P840 es indispensable para:
Recepción de energía lumínica proveniente de los complejos antena
Separación de cargas
Transferencia de electrones a clusters de proteinas-ferrodoxinas Fe–S, a niveles de energía mucho menores (mas negativos) que los requeridos por las quinonas de bacterias púrpura, lo que permite reducir directamente NAD+.
ETC transfiere la energía desde el par BChla exitado hacia FeSA/B, y finalmente a ferrodoxinas Fd citoplasmáticas altamente reductoras, (514-584 mV) , lo que proporciona potenciales suficientes para reducir NADP + vía ferrodoxina/NADP+ oxidoreductasa, lo que habilita las cadenas memtabólicas responsables de la fijación de carbono.
En cuanto a la síntesis de ATP, a la fecha no hay claridad sobre la ruta responsable de generación de la PMF requerida para la activación de ATP synthase.
En primer lugar, en la cadena de transporte de electrones no participan de manera directa quinonas, y solo menaquinona MK7 está presente en lo que prodría definirse como pool de quinonas.
Por otro lado, a pesar de que GSB contiene genes codificantes de Cyt b y Rieske Fe/S (PetB y PetC respectivamente), no ha sido descrito a la fecha genoma codificador de Cyt c1 y Cyt f , de manera que una ruta cíclica equivalente a la vía Cyt bc1 de bacterias púrpura no ha sido demostrada para GSB. El rol de Cyt b y Rieske Fe/S en el complejo es sujeto de investigación.
De manera alterna, es posible que la acción combinada de ferredoxina como agente reductor de MK7 y NADP deshidrogenasa como fuente de protones, ver Fig.2., permita generar MKOH, de modo que la translocación de protones en una etapa oxidativa subsiguiente de MKOH -> MK7 para síntesis de ATP pueda ocurrir . La reducción de MK7 puede tambien provenir de FeS o la fuente de electrones del sistema. Independiente del agente reductor, no ha sido posible caracterizar complejos oxidantes de MKOH que soporten la teoría, así que la ruta de generación de PMF y retorno de electrones al sistema en alguna vía alterna a Cytc1-Cyt C soluble también está por aclararse. En la Fig 2., las líneas punteadas representan rutas probables no demostradas.
Figura 2. Diagrama de flujo de las probables rutas fotosintéticas en GSB, incluyendo consumo de NADPH para síntesis de ATP. Líneas punteadas indican rutas no demostradas.
Para complementar el tema, la Fig 3 describe la ruta de síntesis de NADPH en bacterias púrpura mediante el consumo de ATP.
Figura 3. Diagrama de flujo de la síntesis de NADPH a partir de consumo de ATP en bacterias ´púrpura
En resumen, mientras que en bacterias púrpura, debido a su naturaleza débilmente reductora, se hace necesario “invertir” parte del ATP producido para sintetizar NADPH, en GSB, dada su naturaleza fuertemente reductora pero débilmente oxidante, una fracción de NADPH es la que se debe utilizar durante la síntesis de ATP.
Puesto que la incorporación de carbono a partir de CO2 depende de la disponibilidad tanto de NADPH como de ATP en las rutas reductoras (Ciclo de Calvin-Benson y TCA Reverso, entre otros) , y puesto que parte de estos agentes debe ser direccionado hacia la síntesis de los mismos, los aparatos fotosintéticos de Bacterias púrpura y GSB tienen en común una eficiencia limitada. La situación en bacterias púrpura y GSB recuerda la paradoja de la serpiente, quien para sobrevivir, requiere alimentarse de sí misma.
Figura 4. Paradoja de la serpiente
Hace unos 2,000 millones de años, en un proceso de endosimbiosis bioquímica, dos grupos bacterianos, con rutas bioquímicas similares a las mencionadas, fusionaron de alguna manera sus maquinarias fotosintéticas dando origen a un único complejo fuertemente oxidante, fuertemente reductor, lo que por un lado eliminó la necesidad de consumo de productos reductores para síntesis de sí mismos, y por otro lado habilitó la utilización de H2O como una nueva e ilimitada fuente de electrones.
Las consecuencias de dicha convergencia evolutiva marcaron un punto de inflexión en la vida en el planeta, pero esto será tema para las próximas lecturas.
Finalmente, y para cerrar la lectura, la figura 5 desribe de manera resumida el aparato fotosintético en GSB.
Figura 5. Aparato fotosintético en bacterias verdes del azufre
Antes de abordar el tema de pigmentos fotosintéticos, es conveniente revisar la estructura atómica y molecular del carbono.
La Figura 1 ilustra de manera gráfica la distribución electrónica y los niveles de energía de los orbitales atómicos en el estado Ground y en los estados exitados sp3, sp2 y sp.
Estado exitado sp3 : Los cuatro electrones porvenientes de los orbitales 2s y 2p se hibridizan en un nivel equipotente de energía intermedio entre los niveles 2s y 2p, conduciendo a cuatro electrones sp3 separados espacialmente 109,5° formando un tetraedro regular.
Estado sp2 : Tres de los cuatro electrones se hibridizan de manera planar, separados 120° entre sí, quedando libre de hibridación el electrón 2pz cuya distribucion de probabilidad es perpendicular al plano sp3.
Estado sp: , Solo dos electrones se hibridizan y sus distribuciones de probabilidad se ubican sobre el eje x. En este caso, los dos electrones, 2py y 2pz se distribuyen a 90° entre sí en un plano perpendicular al eje x.
Figura 1. Orbitales atómicos Ground y exitados del átomo de carbono.
En los pigmentos fotosintéticos, Enlaces C=C alternan con enlaces C-C , sea de manera lineal (carotenos) o en anillo (clorofilas), formando lo que se denomina enlaces conjugados. Los enlaces C=C corresponden al estado exitado sp2 , en el que participan dos electrones: uno de los tres electrones híbridos sp2 y el electrón 2pz, ver Figura 2. Los dos electrones sp2 se alinean sobre un mismo eje, conformando un orbital molecular σ, mientras que los electrones 2pz se alinean de manera paralela, conformando un orbital molecular π.
Figura 2. Orbitales moleculares para un enlace C-C correspondiente a sp2
Dependiendo del estado de fase, dos tipos de enlaces σ pueden presentarse: Bond, con funciones de onda en fase, y Antibond, con las funciones de onda desfasadas 180° entre sí, ver Fig 3.
Figura 3. Orbitales moleculares σ y σ* , Bond y Antibond, dependiendo de los estados de fase de los electrones participantes..
Orbitales moleculares tipo σ y σ* ocurren también entre orbitales atómicos px, ver Fig 4, mientras que py y pz interactuan de manera paralela conformando orbitales moleculares π y π*, ver Fig.5.
Figura 4. Orbitales moleculares σ y σ* entre orbitales atómicos Px
Figura 5. Orbitales moleculares π y π* entre orbitales atómicos py – py y pz-pz
La figura 6 describe los niveles de energía de los orbitales moleculares correspondientes a los elementos del grupo 2 de la tabla periódica.
Figura 6. Niveles de energía de los Orbitales moleculares para los elementos del grupo 2 de la tabla periódica.
Partiendo de los niveles de orbitales moleculares especificados en la fig.6., se dpuede definir el diagrama orbital molecular (MO Diagram) correspondiente al enlace C=C presente en los enlaces conjugados de los pigmentos fotosintéticos; ver Fig 7.
Figura 7. Diagrama orbital molecular (MO Diagram) para el enlace C=C en estado Ground
HOMO – LUMO
Los términos HOMO / LUMO hacen referencia a los orbitales “Highest Occupied Molecular Orbital” y “Lowest Unoccupied Molecular Orbital”, que, para el caso del enlace C=C especificado en la Fig.7., corresponden a los orbitales moleculares π y π*, respectivamente.
Se mencionó anteriormente que el orbital molecular π es un orbital “Bonding” en el cual las funciones de onda de los electrones que participan están en fase, ver Fig.5., mientras que π* es un enlace “Antibonding” , en desfase de 180°.
Cuando un fotón incide sobre un electrón π con un energía exactamente igual a la diferencia entre los niveles de energía (π* – π), en electrón se exita pasando del nivel π al π* , esto es, de HOMO a LUMO, ver Figura 8.
Figura 8. Diagrama orbital molecular (MO Diagram) para el enlace C=C en estado exitado
Los diagramas propuestos por Richard Feynman describen de una manera elegante la interacción fotón-electron, aplicable a los pigmentos fotosintéticos, ver Fig 9.
Figura 9. Diagrama de Feynman correspondiente a l salto de energía de un electrón π ground (HOMO) a su estado exitado π* (LUMO)
La exitación electrónica HOMO-LUMO de π a π* es el fenómeno natural al cual la vida a travez de la fotosíntesis ha recurrido para aprovechar la energía solar, con el único propósito de mantener su estructura y función orgánica, lo que viene a ser el motor mismo de la vida en nuestro planeta.
ESTADOS TRIPLETE Y SINGLETE
En adición a la energía de exitación inherente al tránsito HOMO-LUMO del electrón (π -> π*) , el momento angular del electron, denotado por S, o Spín, juega igualmente un rol importante en la captura de energía y relajación en los procesos fotosintéticos.
El Spin es un número cuántico inherente a las partículas que conforman el universo. En el caso de los fermiones, a los cuales pertenece el electrón, su valor siempre es S=1/2, y su proyección sobre el eje z, o sz , puede tomar los valores +1/2 (up ↑) y -1/2 (down ↓).
Matemáticamente,
Los dos eigenvalues de Sz, , corresponden a los siguientes eigenspinors:
Para un sistema conformado por dos electrones, hay dos estados de importancia en los procesos fotosintéticos:
Estado triplete: Comprende tres estados antisimetricos con spin total S=1
Componentes: ms=+1 , ms = 0 , ms −1, donde
∣T1⟩=∣↑↑⟩
∣T0⟩=1/√2 (∣↑↓⟩+∣↓↑⟩)
∣T−1⟩=∣↓↓⟩
Estado singlete (S = 0): Estado simétrico con spin total S=0 .
Componente único : ms=0, donde
∣S⟩=1/√2(∣↑↓⟩−∣↓↑⟩)
Por regla general, para dos electrones en el mismo sistema, el estado singlete (estado simétrico) suele tener mayor energía que el estado triplete, debido principalemente a que un estado simétrico permite mayor cercanía entre el par de electrones que en estados antisimétricos, lo que aumenta la repulsión coloumbiana.
En la fotosíntesis y otros fenómenos bioquímicos, una e las estrategias de de-exitación se conoce como Inter-System Crossing, ISC. Electrones pueden pasar de estados Singlete de alta energía a estados triplete de menor energía, ver Fig. 10, como un paso intermedio para retorno a GND.
Figura 10. IC – ISC como rutas de De-exitación no radativa.
ENLACES CONJUGADOS
Como se mencionó, cadenas y anillos con alternancia de enlaces simples ( σ) y dobles (σπ) se denominan enlaces conjugados. ver Fig.11. En este tipo de arreglos, los electrones π se deslocalizan, lo que otorga una gran estabilidad a la molécula a mas de ser fenómeno base de sus propiedades resonantes.
La diferencia de energía (π* – π) en los pigmentos fotosintéticos depende de numerosos factores, intramoleculares e intermoleculares. Los enlaces conjugados, como parte de la estructura molecular, definen en buena medida el valor de dicha diferencia .
Figura 11. Estructura molecular de la porfirina, con un anillo conformado por 9 enlaces σπ alternando con 9 enlaces σ.
A mayor número de enlaces conjugados por pigmento menor la distancia energética (π* – π), lo que se traduce, en pigmentos fotosintéticos, a absorber fotones a menores energías, tan bajas como el infrarrojo cercano.
Cada grupo biológico dependiente de la fotosíntesis tiene su entorno característico, con una luminosidad característica, lo que implica que la maquinaria fotosintética debe sintonizarse con la fuente de energía disponible. El ajuste de la diferencia HOMO-LUMO es la herramienta base para dicha sintonización.
No quisiera cerrar esta lectura sin mencionar a un personaje que de una u otra manera entendió la importancia de la luz en el universo.
Me refiero al faraón Akhenaton, uno de los últimos faraones de la dinastía XVIII, quien en medio de un gobierno teocrático politeista se atrevió a implementar, por primera vez en la historia de la humanidad, el monoteismo en su reino. Así, el culto a Ra, el dios sol, se convirtió en el centro de la religión durante su regencia . Esta “herejía”, opuesta al zoológico de dioses defendidos por los sacerdotes de la época, marcó el principio del fín de su dinastía, quedando sin embargo “grabado en piedra” para la posteridad su aporte al reconocimiento del papel de la energía electromagnética, entiendase Ra, sol, luz o fotón, en la vida y evolución de nuestro planeta.
Obviamente, tras Akhenaton vinieron aportes menos religiosos y más científicos, dentro de los que cabe resaltar los aportes de J.C. Maxwell, Max Plank , Albert Einstein y Richard Feynman, entre otros, pero eso debería ser tema para otras lecturas.
Figura 1. Vista 3D de la enzima Rubisco, responsable de la fijación de carbono en el ciclo de Calvin-Benson.
El ciclo de Calvin-Benson es de lejos el ciclo reductor mas importante en la naturaleza, presente en varios grupos bacterianos, algas y plantas superiores.
La manera más común de representar el ciclo se ilustra en la Fig 2.
Figura 2. Ilustración general del ciclo de Calvin-Benson
Varios elementos a resaltar:
Se trata de un ciclo reductor, responsable de la biosíntesis a partir de Gliceraldehido 3 fosfato (G3P) , mediante incorporación de CO2, ruta característica y propia de los procesos fotosintéticos.
El ciclo requiere energía externa, en forma de ATP y NADPH
El ciclo comprende tres fases: Carboxilación, Reducción y Regeneración
Durante la fase de carboxilación, 3 moléculas de CO2 son incorporadas al ciclo, y en conjunto con 3 moléculas de H2O y tres de Ribulosa 1-5 bifosfato se producen seis moléculas de 3-fosfoglicerato. En esta fase la enzima Rubisco (Ribulosa 1-5 bifosfato carboxilasa oxigenasa) es la responsable de la carboxilación.
En la fase reductora, seis moléculas de Gliceraldehido 3-fosfato (G3P) son sintetizadas a partir de igual número de moléculas de 1-3 bifosfoglicerato.
Finalmente, en la fase de regeneración, cinco de las seis G3P producidas previamente se destinan a la regeneración de 3 moléculas de Ribulosa 1-5 bifosfato, la sexta G3P es extrída del clico para biosintesis o como reserva de energía, propósito fundamental del proceso.
Lo que la Fig 2. no muestra es la complejidad de la fase de regeneración.
Para ilustrar de la mejor manera esta fase resulta mucho mejor “abrir” el ciclo, ver fig 3., con tres moléculas de Ru-1-5-BP iniciando la ruta metabólica y “OTRAS” tres finalizandolo, lo cual de paso es la manera mas estricta de representar el proceso. El hecho de que la ruta se repita ciclicamente no quiere decir que sea circular, lo que implicaría las que las mismas moléculas de Ru-1-5 BP son las que incician y cierran el ciclo.
Como se mencionó arriba, una de las seis moléculas de G3P producidas durante la fase de reducción se destina a biosintesis (o como reserva de energía), mientras que las cinco restantes se destinan a la regeneración de Ru-1-5BP.
Figura 3. Representación alterna de la Ruta metabólica de Calvin-Benson
Se incluyen en la parte superior de la figura las dos rutas de biosíntesis más relevantes: La biosíntesis de almidón (en el cloroplasto de plantas superiores) y la biosíntesis de sucrosa (en el cytosol).
Para facilitar la comprensión del proceso, moléculas orgánicas de tres carbonos se representan como triángulos, de cuatro como cuadrados, de cinco como pentágonos, etc.
La aritmética implicada en el reagrupamiento de carbonos en la fase de regeneración, esto es, la síntesis de tres moléculas de cinco carbonos (Ribulosa 2-5 bifosfato) a partir de cinco moléculas de tres carbonos (Gliceraldehido tres fosfato) se resume en la fig 4.
Figura 4. Aritmética de la fase de regeneración en el ciclo de Calvin-Benson
Otra manera de visualizar la fase de regeneración es mediante un diagrama de evolución temporal en el número de carbonos/molécula, ver Fig 5.
Figura 5. Evolución de carbonos a lo largo de la fase de regeneración
Lo que permite analizar este gráfico es la distribución de densidad de carbonos por molécula alrededor del objetivo final (5 carbonos).
Una manera de cuantificar esta densidad es a travez de un índice de variacion I, de acuerdo a la fórmula especificada en la figura. Para este caso, 2,36 es el valor calculado del índice de densidad de carbonos, teniendo en cuenta las moléculas precursoras de tres carbonos, G3P, moléculas intermedias de 4, 6 y 7 carbonos, ver fig.3, y las moléculas objetivo, Ru-1-5 BP.
No existe una fase de regeneración alterna que aporte un úndice inferior a 2,36. El número de carbonos oscila entre 3 y 7 carbonos, cualquier alternativa con moléculas de menos de tres carbonos o más de siete termina arrojando un índice mayor.
A manera de ejemplo, analizemos una ruta alterna como la especificada en la fig. 6.
Figura 6. Aritmética alterna de carbonos a lo largo de la fase de regeneración
En este caso, en lugar de la síntesis de F1-6BP (fructuosa bifosfato) a partir de G3P y DHP, con alguna enzima podría generarse X5P precursor de Ru1-5BP y una molécula orgánica de un carbono, que fosforilada convenientemente (inversión en energía), podría integrarse a un G3P para formar E4P .
Lo demás quedaría igual.
Esta modificación metabólica en la fase de regeneración termina generando cambios significativos en la densidad de carbonos, ver fig.7., como lo demuestra el nuevo índice de densidad calculado I=3,73 vs I=2,36 en el caso real.
Figura 7. Evolución alterna de carbonos a lo largo de la fase de regeneración
Con este ejercicio la pregunta que surge es, cuál es el significado del índice de densidad de carbonos?
En primer lugar, la energía invertida en cualquier otra ruta de regeneración alterna debe incrementarse,en el caso presentado por la integración de moléculas de un carbono a G3P, cuya activación por fosforilación implica inversión adicional de ATP, pero también por la energía invertida en la síntesis de enzimas adicionales para habilitar la ruta alterna.
Teniendo en consideración que la vida y su fenomenología bioquímica no son ni pueden ser una excepción a las reglas del universo, lo que se está midiendo es el costo metabólico de las rutas metabólicas, correspondiendo el menor costo, menor esfuerzo o mínima acción, a la ruta seleccionada por la naturaleza, lo que debe tener un equivalente discreto de la minima acción de la mecánica lagrangiana aplicada a fenómenos coninuos, acción que finalmente es la medida de la evolución temporal de las energías cinéticas y potenciales del sistema.
, corresponden a los siguientes eigenspinors: 
Andeantrees 